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凝膠成像系統(tǒng)如何進(jìn)行精確定量與分子量分析

點(diǎn)擊次數(shù):106  更新時間:2025-10-09
  凝膠成像系統(tǒng)通過光學(xué)成像與軟件分析結(jié)合,可實(shí)現(xiàn)分子量精確定量及濃度分析,其核心流程與技術(shù)要點(diǎn)如下:
  一、分子量精確定量原理與步驟
  標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建
  系統(tǒng)利用已知分子量的DNAMarker條帶作為參照,通過軟件標(biāo)注其位置并生成分子量-遷移距離的擬合曲線。該曲線基于電泳中分子量與遷移率的線性關(guān)系,確保未知條帶分子量計算的準(zhǔn)確性。例如,DNA膠片上Marker條帶的分子量(如100bp、500bp、1000bp)被標(biāo)注后,系統(tǒng)自動擬合曲線,用于后續(xù)未知條帶的分子量推算。
  未知條帶分子量計算
  將待測樣品電泳后的凝膠置于成像系統(tǒng),通過紫外或可見光源激發(fā)熒光(如EB染色),軟件捕捉圖像后,根據(jù)未知條帶在凝膠中的遷移位置,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其分子量。此方法比肉眼估計更精確,誤差可控制在±5%以內(nèi)。
  二、濃度精確定量方法
  密度標(biāo)定與對比
  系統(tǒng)先標(biāo)定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)條帶(如DNA膠片上某條帶的DNA含量),再通過軟件點(diǎn)擊未知條帶,比較其與標(biāo)準(zhǔn)條帶的密度差異,計算未知樣品濃度。例如,若標(biāo)準(zhǔn)條帶密度為100單位,對應(yīng)濃度為50ng/μL,未知條帶密度為50單位,則其濃度約為25ng/μL。
  光密度線性關(guān)系
  樣品對光的吸收量與濃度或質(zhì)量呈線性關(guān)系。系統(tǒng)通過測量條帶的光密度(灰度值或熒光強(qiáng)度),結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線或已知樣品數(shù)據(jù),推算未知樣品濃度。此方法適用于DNA、RNA及蛋白質(zhì)凝膠(如PAGE膠)的濃度測定。
  三、關(guān)鍵技術(shù)保障
  光學(xué)系統(tǒng)優(yōu)化
  采用紫外透射光源或白光透射光源,確保光分布均勻,減少光密度不均對結(jié)果的影響。高分辨率CCD或數(shù)碼相機(jī)捕捉圖像,結(jié)合暗箱設(shè)計屏蔽外部光源干擾,提升成像質(zhì)量。
  軟件分析功能
  軟件支持背景扣除、條帶分割、密度掃描等操作,可生成縱向掃描曲線圖并積分,實(shí)現(xiàn)精確定量。例如,PCR定量中,軟件可計算各條帶占總條帶的相對百分?jǐn)?shù),密度掃描則生成條帶灰度值的縱向分布曲線。
  四、應(yīng)用場景與優(yōu)勢
  分子生物學(xué)研究:精確測定DNA/RNA分子量及濃度,輔助基因克隆、測序驗(yàn)證。
  蛋白質(zhì)工程:定量分析蛋白表達(dá)產(chǎn)物占比,優(yōu)化發(fā)酵工藝。
  藥物開發(fā):通過濃度測定評估藥物純度,確保質(zhì)量控制。
  該系統(tǒng)通過標(biāo)準(zhǔn)化流程與先進(jìn)技術(shù),實(shí)現(xiàn)了分子量與濃度的雙重精確定量,為生命科學(xué)研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。
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